操作流程：

方案一、试管检测

1、试剂准备

1.1 取适量5mg/mL 蛋白标准，PBS 稀释至终浓度为0.5mg/mL 蛋白标准。配制后可立即使

用，也可以-20°C 长期保存；

1.2 根据样品数量，按50 体积BCA 试剂A 加1 体积BCA 试剂B(50:1)配制适量BCA 工作液，

充分混匀。BCA 工作液室温24 小时内稳定；

例如：5mLBCA 试剂A 加100μLBCA 试剂B，混匀，配制成5.1mL BCA 工作液。

1.3 稀释BSA 标准品：用与待测蛋白样品相一致的稀释液按下表稀释BSA 标准品。

表1：BSA 标准品配制表

1.4 取干净的试管，分别加入200μl 待测蛋白样品(原液或稀释液)，并作好标记，推荐每个样品做2-3 个平行反应。

2、样品孵育及检测

2.1 在各标准品及待测样品管中分别加入2mL BCA 工作液，37°C 放置20-30 分钟；

注: 也可以室温放置2 小时，或60°C 放置30 分钟。BCA 法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断

加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。

2.2 测定A562，540-595nm 之间的波长也可接受。

3、制作标准曲线和计算样品浓度

3.1 利用Excel 或其他软件绘制标准曲线，并计算样品中的蛋白浓度。

3.2 如果所得到的蛋白浓度不在检测范围内，请重新稀释样品后再次测定。

方案二、微孔板检测

1、试剂准备

1.1 取适量5mg/mL 蛋白标准，PBS 稀释至终浓度为0.5mg/mL 蛋白标准。配制后可立即使用，也可以-20°C 长期保存；

1.2 根据样品数量，按50 体积BCA 试剂A 加1 体积BCA 试剂B(50:1)配制适量BCA 工作液，充分混匀。例如5mLBCA 试剂A 加100μLBCA 试剂B，混匀，配制成5.1mL BCA 工作液。BCA

工作液室温24 小时内稳定；

1.3 稀释BSA 标准品：在微孔板中，按表2 用待测蛋白样品相一致的稀释液直接稀释BSA标准品,。

表2：BSA 标准品配制表

1.4 在微孔板的样品孔中，分别加入20μL 待测蛋白样品(原液或稀释液)，并作好标记，推荐每个样品做2-3 个平行反应。

2、样品孵育及检测

2.1 在各标准品及待测样品孔中分别加入200μL BCA 工作液，37°C 放置20-30 分钟；

注: 也可以室温放置2 小时，或60°C 放置30 分钟。BCA 法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。

2.2 测定A562，540-595nm 之间的波长也可接受。

3、制作标准曲线和计算样品浓度

3.1 利用Excel 或其他软件绘制标准曲线，并计算样品中的蛋白浓度。

3.2 如果所得到的蛋白浓度不在检测范围内，请重新稀释样品后再次测定。

注意事项:

1、在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37°C 温育使溶解, 如发现细菌污染则应丢弃；

2、样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford 蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA 沉淀去除干扰物质；

3、要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔, 每次均应做标准曲线；

4、需准备37°C 水浴或温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为540-595nm 之间，562nm 最佳。酶标仪需与96 孔微孔板配套使用。使用分光光度计测定蛋白浓度时，试剂盒测定的样品数量会因此而减少。使用温箱孵育时，应注意防止因水份蒸发影响检测结果。

温馨提示

为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等。