DiO是一种亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。进入细胞膜后，DiO在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，被激发后可以发出绿色的荧光，具有很高的淬灭常数和激发态寿命。可以用标准的FITC滤光片检测。

DiO通常不会明显影响细胞的生存力，因此被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂（long-term tracer）。除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移，通过FRAP（Fluorescence Recovery After Photobleaching）检测脂在细胞膜上的扩散，检测细胞毒性和标记脂蛋白等。

使用方法

1. 染色液制备

1.1、配置DMSO或EtOH 储存液：储存液用DMSO或EtOH配置浓度1～2 mM。

【注】：a、未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融，可稳定保存6个月。

b、发现较难溶解时可以适当加热，并用超声处理以促进溶解。

c、必须保证所用溶剂新鲜无水。

1.2、工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储存液，配制浓度为1～5 μM的工作液。

【注】：工作液最终浓度建议根据不同细胞系和实验体系来优化。

2. 悬浮细胞染色

2.1、加入适当体积的染色工作液重悬细胞，使其密度为1×10⁶/mL。
2.2、37℃孵育细胞2～20 min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以2 min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。

2.3、孵育结束，按1000～1500 rpm离心5 min。

2.4、倾倒上清液，再次缓慢加入37℃预热的生长培养液重悬细胞。

2.5、重复2.3，2.4步骤两次以上。

3. 贴壁细胞的染色

3.1、将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。

3.2、从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。

3.3、在盖玻片的一角加入100 μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
3.4、37℃孵育细胞 2～20 min，不同的细胞最佳培养时间不同。可以20 min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。

3.5、吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5～10 min，然后吸干培养基。

4. 显微镜检测

4.1设定对应滤光器即可检测。

C₅₃H₈₅ClN₂O₆

DMSO/EtOH