MitoTracker Red CMXRos是一种红色荧光染料，用于对活细胞线粒体进行染色，并且该染料的积累取决于膜电位。经醛固定后染料保留良好。

产品特征

1）分子式：C32H32Cl2N2O

2）分子量：531.52

3）外观：固体

4）Ex/Em：~579/599 nm

5）溶解性：溶于DMSO（1mM）

注意事项：本品属于微量产品，请勿分装称量。整个操作过程需注意避光。

使用方法

1. 储存液的配制

使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简单低速离心使溶液降至管底。之后加入94.0698μL高质量无水的DMSO溶解MitoTracker Red CMXRo（Mw=531.52 g/mol），使其浓度为1mM。储存液最好能现用，若用不完，请根据单次用量分装，≤-20℃避光保存。

2. 工作液的配制

根据不同的实验目的使用不同的探针浓度，以下的起始操作条件仅作参考，可根据细胞类型和其他的相关因素如细胞或组织的透化等进行适当调整。

利用培养基或合适的缓冲液将1mM储存液稀释至工作浓度，工作液需现配现用。常用的工作浓度范围是25-500nM，但对于后续需要进行固定和透化的细胞染色，建议使用工作浓度范围在100-500nM。为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。

3. 染色步骤（贴壁细胞）

1）将细胞置于培养皿中的盖玻片上，加入合适培养基，使其爬片生长。

2）待细胞生长到合适密度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针培养基。于特定的生长状态下孵育15～45min（具体孵育时间需根据细胞类型而定）。

3）利用新鲜培养基替换上述染色液并在荧光显微镜（含合适滤片）或荧光酶标仪下观察。若细胞需固定和透化，参考染色后的固定和透化流程。

4. 染色步骤（悬浮细胞）

1）离心沉淀细胞，吸除上清。

2）利用37℃预热的含探针培养基重悬细胞，于特定的生长状态下孵育15～45min（具体时间需根据细胞类型而定）。

3）离心，吸除染色液，加入新鲜培养基重悬细胞。

4）用含合适滤片的流式细胞仪、基于酶标板的分析仪或荧光显微镜观察。如果需要将细胞固定在盖玻片上，于固片前用poly-D-lysine包被载玻片或者盖玻片。若细胞后续需要固定或透化，参考染色后的固定和透化流程。

5.染色后的固定和透化流程

1） 染色后，用新鲜预热的缓冲液或生长培养基清洗细胞；

2） 小心吸掉覆盖细胞的缓冲液或培养基，用含2-4%多聚甲醛的新鲜配制预热的缓冲液或培养基来固定。研究显示内皮细胞用3.7%多聚甲醛溶液于37℃固定约15min效果很好。

3） 固定之后，用缓冲液清洗细胞几次；

4） 【可选】若后续步骤如ICC需要透化，则用含表面活性剂如Triton X-100的缓冲液来透化细胞。一旦透化结束，用缓冲液清洗细胞并进行后续ICC流程。研究显示，用含0.2% Triton X-100的PBS缓冲液透化内皮细胞10min效果很好。

做为备选方案，细胞也可以用冰丙酮透化处理5min，之后用PBS清洗。即使后续细胞不用进行其它抗体标记，这一丙酮透化步骤也可能改善信噪比。