FerroOrange是一种特异性检测不稳定的铁(II)离子（Fe2+）的荧光探针，定位在内质网（ER）。一旦与Fe2+反应后，不可逆的生成一种橙色荧光产物（Absmax=542nm，FLmax=572nm，图①. FerroOrange的光谱特征）。铁（III）离子（Fe3+）或其它除铁离子以外的二价金属离子都不会使其荧光增强（见图②. FerroOrange的反应特异性）。FerroOrange也不会与铁蛋白和其它物质中的螯合铁反应。FerroOrange具强细胞膜渗透性和低细胞毒性，非常适用于活细胞成像。

     图① ：FerroOrange的光谱特征。FerroOrange在0.05M HEPES buffer, pH 7.4内的吸收光                  谱（L）和荧光光谱。吸收波长在542nm，荧光光谱在572nm。一旦与Fe2+反应，                    荧光强度显著增加。

     图②：FerroOrange的反应特异性。FerroOrange与各种金属离子（L），活性氧或还原剂（                 R）的反应性。仅当与Fe2+反应，FerroOrange呈强荧光。

使用说明

1. 需要自行准备的材料

    1)  细胞培养级DMSO;

    2)  合适的清洗和观察缓冲液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；无血清培养基等）,不含酚红。

2. 探针准备

    1)  从冰箱取出FerroOrange，置于室温至少30min，将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后，再开盖；

    2)  往一管FerroOrange（24μg）内加入35μl高质量DMSO，用枪反复吹吸5次或以上，使其wan全溶解即得到1mMFerroOrange储存液。若单次           不能用完储存液，请根据单次用量分装，置于-20℃避光保存，一个月内使用；

    3)  于正式实验前，用中性缓冲液或细胞培养基来稀释1mM FerroOrange储存液到所需工作浓度（比如：1μM），工作液需现配现用，尽快用                 完。[ 注：酸性溶液会氧化FerroOrange，严重影响探针的效率 ]。

3. 染色步骤

    1)  于荧光培养皿中接种细胞，于37℃，5% CO2培养箱中孵育过夜;

    2)  染色步骤。

4. 荧光检测

    1)  对于激光显微镜和流式细胞仪：532nm，514nm或561nm激光器用于激发。实在没有，亦可用488nm激光器。发射波长为572nm。

    2)  对于荧光显微镜：通用的G激发滤片比如Cy3检测用的滤片。