绿色线粒体超氧化物荧光探针是一种高度特异性检测活细胞线粒体超氧化物的新型荧光探针，具有细胞膜渗透性，能快速选择靶向线粒体。一旦进入线粒体，MitoSOX Green被超氧化物氧化，呈现明亮的绿色荧光（Ex/Em：~488/510nm），能够通过荧光显微镜被测定到。

MitoSOX Green由于能直接检测活细胞线粒体超氧化物，从而避免因分离纯化线粒体再进行检测可能存在人为操作引起的误差。MitoSOX Green是可用来筛选多种疾病种调节氧化应激的药物。

Figure 1   Selectivity of MitoSOX™ Green Mitochondrial Superoxide Indicators

产品特点：

1，容易为超氧化物而不是其他的ROS、RNS生成系统氧化

2，吸收波/发射波最大值：~488/510nm（传统的FITC/GFP滤光片）

3，适用于活体成像

4，快速选择靶向线粒体

5，溶解性：DMF（1mM）

应用示例（活细胞染色）：

U2OS cells treated with 30 µM MitoPQ overnight to induce mitochondrial superoxide production. Cells were stained with (B) 1 µM MSG reagent for 30 minutes and then imaged in HBSS with Calcium and Magnesium.

注意事项：整个操作过程需注意避光。

使用方法：

1，储存液配制

使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简单低速离心使溶液降至管底。之后用10μl高质量DMF溶解MitoSOX Green（9μg/管），混匀后即得到1mM储存液。储存液最好是当天用完。实在用不完请≤-80°C避光干燥保存，需尽快使用。

2，工作液配制

将10μl MitoSOX Green储存液（1mM）加入10ml 含钙镁的HBSS（货号：MS3505-500ML）或其他缓冲液。需要注意的是，虽建议的工作浓度是1μM，但用户需根据不同的细胞类型在0.5-5μM之间进行工作浓度的优化，最大化信噪比和最小化细胞毒性。工作液建议1h内使用。

3，对照组准备（可选）

4，活真核细胞的染色步骤

以下实验步骤是专门开发用于爬片培养的牛肺上皮细胞（BPAE）、MRC5人肺成纤维细胞和小鼠3T3成纤维细胞，其他细胞类型可做适当调整。建议以下步骤仅作起始条件，根据实际需求做优化调整。

4.1对于爬片生长的细胞（35mm培养皿）往内加入1-2ml 新鲜制备的MitoSOX Green工作液；对于96孔板的细胞往内加入100μl 新鲜制备的MitoSOX Green工作液。必须使用足量的工作液来完全覆盖细胞。

4.2于37℃，5% CO2中染色30min。

4.3用预热的清洗缓冲液（含钙镁的HBSS或其他合适的生理缓冲液）轻轻清洗细胞3次。

4.4按需加入复染剂染细胞（可选），之后封片，进行成像分析（Ex/Em：~488/510nm）。需在染色2h内完成荧光观察。